全基因组甲基化测序服务

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þ 全基因组甲基化测序

DNA甲基化对生命活动非常重要,是基因调控的手段之一。DNA的甲基化状态对染色体的结构维持、X染色体失活、基因印记以及胚胎发育、正常细胞功能维持,乃至疾病、癌症发生都是十分重要的。全基因组甲基化测序是将重亚硫酸盐(Bisulfite)处理方法和Illumina高通量测序相结合,对有参考基因组信息的物种进行全基因组范围内的甲基化水平的测序。全基因组甲基化可以精确到单碱基分辨率,精确分析每一个C碱基的甲基化状态,从而构建全基因组甲基化图谱。全基因组重亚测序达到全基因组覆盖, 是研究甲基化水平的“金标准”。

全基因组甲基化测序结合了亚硫酸氢盐转化(bisulfite conversion)方法与新一代高通量测序技术,可在单碱基分辨率水平上高效地检测全基因组DNA甲基化状态。亚硫酸氢盐处理可以使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,PCR扩增所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。对 PCR产物进行高通量测序,与参考序列比对,即可判断CpG/CHG/CHH位点是否发生甲基化。



许多方法利用NGS的高质量和灵敏度来进行甲基化分析。大多数方法依赖于DNA的重亚硫酸盐转化来检测未甲基化的胞嘧啶。在文库制备过程中,重亚硫酸盐将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶。转化后的碱基在测序中被识别为胸腺嘧啶(PCR后),并通过序列计数来确定甲基化胞嘧啶的比例。

重亚硫酸盐转化测序可通过靶向方法完成,如扩增子甲基化测序(Methyl-seq),或全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)。此外,TAB-Seq和OxBS等替代方法也利用NGS来鉴定羟甲基化(5-hmC)并开展甲基化(5-mc)分析。


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全基因组甲基化测序实验路线


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全基因组甲基化测序技术路线


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全基因组甲基化测序样品要求(基因组DNA)


  ²  样品纯度:OD 260/280值应在1.8~2.0 之间; RNA 应去除干净;

  ²  样品浓度:最低浓度不低于50ng/µl

  ²  样品总量:每个样品总量不少于6µg

  ²  样品溶剂:应溶解在H20TE (pH 8.0)中;

  ²  样品运输:DNA低温运输(-20℃);在运输过程中用parafilm将管口密封好,以防出现污染。



全基因组甲基化测序数据分析展示


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             图:甲基化位点频率的染色体分布。



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                      图:全基因组基因平均甲基化程度分布展示。



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  图:甲基化位点分布与CpG岛的位置关系。



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                                       图:样本染色体甲基化程度分布。


癌症中的表观遗传改变
甲基化异常

癌症中表观遗传改变的研究,如甲基化异常和转录因子结合的改变,可提供重要的致瘤通路的线索。由于甲基化改变往往会激活或沉默基因,表观基因组的变化可能影响基因表达和癌症发展的速度。

复杂疾病的甲基化图谱分析
甲基化图谱分析

全基因组的甲基化图谱分析可帮助研究人员了解在复杂疾病的病例中起作用的机制。异常的胞嘧啶甲基化可能影响基因表达,并牵涉到许多疾病过程,如阿茨海默病和哮喘。














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